A kutatás virológiai módszerei

Étrend

A virológiai vizsgálati módszerek széles körben használatosak a virális természet különböző fertőző és bizonyos onkológiai betegségeinek diagnosztizálására.

A virológiai kutatási módszereket használják a vírusok azonosítására, a biológiájuk tanulmányozására és az állatok és az embereket érintő képességükre, amely tovább segíti a vírusos megbetegedések patogenezisének megértését és a megfelelő kezelés módját. A betegség etiológiájának megállapítása és a terápia hatékonyságának ellenőrzése mellett a kutatás virológiai módszerei nagy jelentőséggel bírnak az antiepidémiás intézkedések meghatározásában és lebonyolításában.

A virológiai kutatás közvetlen módszerei

A közvetlen virológiai vizsgálati módszerek kimutathatják a vírust, a virális nukleinsavat vagy a vírusantigént közvetlenül a klinikai anyagban, és így a leggyorsabbak (expressz módszerek - legfeljebb 24 óra). Ezek a módszerek kevésbé informatívak és laboratóriumi igazolást igényelnek közvetett diagnosztikai módszerekkel a hamis negatív vagy hamis pozitív eredmények gyakori beérkezésével kapcsolatban. A következő vizsgálati módszerek közvetlenek:

  • elektronmikroszkópos vírusok festése negatív kontrasztú módszerrel (lehetővé teszi a vírus jelenlétének meghatározását és annak koncentrációját az anyagban, feltéve, hogy 1 ml-ben legalább 105 vírusrészecskét tartalmaz);
  • Immun-elektronmikroszkópia, amely specifikus antitestek és vírusok közötti kölcsönhatásán alapul, olyan komplexekké alakítva, amelyek negatívan kontrasztosabbak, mint a vírusok;
  • enzimkapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) enzimmel jelzett antitestek alkalmazásával, amelyek kötődnek az antigénekhez, és komplexeket alkotnak, amelyeket az alkalmazott enzim szubsztrátjának hozzáadásával azonosítanak;
  • az immunfluoreszcencia reakció (RIF) - közvetlen vagy közvetett - a fluoreszcens festékkel kapcsolatos antitestek használatán alapul;
  • radioimmunoassay (RIA) radiojelzéssel ellátott antitestek és gamma-számlálók használatán alapul;
  • a citológiai módszerek festett kenetek mikroszkópos vizsgálatán, biopsziás mintákon, boncolásokon alapulnak;
  • molekuláris módszerekkel - molekuláris hibridizáció nukleinsavak, és a polimeráz-lánc-reakció (az első alapul kimutatására komplementer szálak nukleinsavak a jelet, és a második - a vírus-specifikus szekvenciák a DNS-replikáció alapvetően három szakaszban).

A nukleinsavak molekuláris hibridizációjának három variánsa van: ponthibridizáció, blot hibridizáció (HIV fertőzés diagnosztizálására), és in situ hibridizáció (közvetlenül a fertőzött sejtekben). A PCR-t (polimeráz láncreakció) egyre gyakrabban használják a vírusfertőzések megfigyelésére és diagnózisára, ennek nagymértékű érzékenysége és specifikussága miatt.

Közvetett virológiai vizsgálati módszerek

Ezek a módszerek a vírus azonosításán és azonosításán alapulnak. Ezek időigényesebbek és hosszadalmasabb technikák, de pontosabbak. Az anyag ilyen vizsgálatok lehetnek a tartalmát vezikulumok, scrapings (varicella, herpeszes elváltozások a bőr és a nyálkahártyák), orr-garati mosás (légzőszervi fertőzések), a vér és gerincvelői folyadék (a arbovirus fertőzések), a székletben (enterovírus fertőzések) mosófolyadékot (a kanyaró, rubeola, stb.). Tekintettel arra, hogy a vírusok is lemásolni csak élő sejtekben, a vírus tenyésztése végezzük szövettenyészetben csibeembrió vagy az állat testének (hörcsögök, fehér egerek, kutyák, macskák, egyes fajok a majmok). Erre utal a vírus által hordozott citopátiás hatás, válaszul gemadsorbtsii a színminta, az eredmények a hemagglutináció gátlási, a változások vagy annak hiánya a csirke embriókat vagy szövettenyészetek, túlélési érzékeny állatok.

A virológiában alkalmazott szerológiai diagnosztikai módszerek

A szerológiai diagnózis az antigén-antitest-reakción alapuló virológiai kutatási módszereket jelenti. Leggyakrabban párosított vérszérumot használnak, melyeket több héten belül szednek. Ha az antitest titer 4-szer vagy annál nagyobb mértékben emelkedik, a reakció pozitívnak tekinthető. A vírusok típusának meghatározásához a vírusneutralizációs reakciót a csoportspecifitás meghatározása céljából alkalmazzuk a komplementkötési reakcióban. A passzív hemagglutináció, a hemagglutinációgátlás, a reverz passzív hemagglutináció, a RIF és az enzim immunoassay különböző változatai szintén széles körben használatosak.

Újabban a génsebészeti tanulmányok során kidolgoztak egy monoklonális antitestek előállítására szolgáló eljárást. A monoklonális szűk specifikusságát számos monoklonális antitest felhasználásával különbözteti meg a különböző vírus determinánsoktól. Ez növelte a virológiai kutatási módszerek érzékenységét és specifitását a vírusantigének meghatározásával. Jelenleg sokféle tesztrendszert hoztak létre a vírusfertőzések immunológiai diagnózisára.

Vírusok tanulmányozásának módszerei.

Történelmileg virológiai leválasztotta mikrobiológia, és még a mikrobiológiai módszerrel nem lehetett használni, ha dolgozik, vírusok, mint az általános alapelveket, aszeptikus technikát, így kapjuk a tiszta vonalak, titrálási módszerek, és végül, oltás képezte az alapját egy új tudomány. A vírusok legfontosabb tulajdonságainak további tanulmányozása számos speciális módszer kidolgozását igényelte. Így a képességét vírusok, hogy áthaladjon bakteriális szűrők segítségével meghatározzuk méretük és tiszta, a kis méret vírusok stimulált létrehozása kifinomultabb mikroszkópos technikák. Műszaki arzenáljának Virology fokozatosan dúsított a módszerek a fizika, a kémia, genetika, citológia, molekuláris biológia és immunológia területén.

A vírusokat mértük és lemértük, kémiai összetételüket, reprodukciós mintáikat, a természet helyét, szerepet játszottunk a betegségek eredetében, és kifejlesztettünk hatékony módszereket a vírusfertőzések leküzdésére. A vírusokat speciális módszerekkel termesztik, laboratóriumi állatok, csirke embriók és szövettenyészet fertőzésével. A virológia hajnalán laboratóriumi állatokon (fehér egerek, tengerimalacok, nyulak) végeztek vizsgálatokat. Bevezették a "gyanús anyagokat", és a betegség mintája alapján ítélte meg, hogy milyen vírus okozta. A vírusok szaporodásához és izolálásához a laboratóriumi állatok mellett kezdtek olyan csirkeembriók kifejlesztése, amelyekben egyes vírusok szaporodnak, felhalmozódnak, néha jelentős mennyiségben.

Az 1950-es évek elejétől kezdve kifejlesztették a szövettenyésztési módszert: az élő szövetek sejtjeit enzimekkel választják el, speciális steril tálcára átvitték, komplex táptalajt adnak hozzá, és termosztátot adnak a növekedéshez. A sejtek megoszlanak és fokozatosan fedik le az üveg felületét egy egyenletes réteggel. Ha ezek a sejtek vírussal fertőzöttek, akkor a megsemmisítő hatásuk közvetlenül megfigyelhető. A szövettenyészet módszere lehetővé tette új vírusok megnyitását és a vírusok és sejtek interakcióját.

A gyakorlati virológia fő módszerei a vírusfajok izolálása, szaporítása és azonosítása. Ez a munka általában két fő részből áll: a vírussal fertőzött sejtek vizsgálata és az izolált vírusok tanulmányozása.

A fertőzött sejtek kimutatására a virológiai diagnosztika különböző módszereit alkalmazzák: a fluoreszcens antitestek módszere, amelyek lehetővé teszik a vírusok jelenlétének egyértelmű azonosítását olyan sejtekben, amelyek külsőleg fertőzöttnek tűnnek; módszer a vírusszaporítás sebességének és természetének rögzítésére, a (teljes vagy részleges) sejtek megsemmisítésén alapulva. A vírusfertőzések diagnózisának fontos szerepe a betegek szérumában lévő specifikus antitestek titerének meghatározása különböző immunológiai reakciók - semlegesítés, komplementkötés, hemagglutinációs késleltetés stb. Segítségével.

ΙΙ. A vírusok szerkezetének és reprodukciójának jellemzői

Hosszú ideig a vírusok létezését kórokozó hatásuk alapján ítélték meg. Közvetlenül a vírusokat csak az elektronmikroszkóp feltalálása után lehetett elérni, tízes és több ezer alkalommal növelve. Ez 50 évvel a vírusok felfedezését követően történt.

A legnagyobb vírusok megközelítik a kis baktériumok méretét, a legkisebb - nagy fehérjemolekulákat, például a vér hemoglobin molekulájához. Más szavakkal, a vírusok között vannak óriások és törpék. A vírusok mérésére egy feltételes értéket használunk, amelyet nanométer (nm) -nek nevezünk. Egy nanometer egy milliméter milliméter. A különböző vírusok mérete 20 és több száz nm között változik. Összehasonlításképpen, megadjuk a legkisebb vértest-eritrociták értékét, amely egyenlő 7000-8000 nm-vel, azaz. a vírusok kevesebbek, mint a vörösvérsejtek tíz és több százszor. A vírusok testének megjelenésével kockák, botok, golyók, poliéderek és szálak hasonlítanak.

Az egyszerű vírusok fehérjékből és nukleinsavból állnak. A vírusrészecske legfontosabb része a nukleinsav - ez a genetikai információ hordozója. Ha az emberi sejtek, állatok, növények és baktériumok mindig tartalmaznak kétféle nukleinsavak - dezoxiribonukleinsav - DNS és ribonuk - RNS-t a különböző vírus kimutatható, csak az egyik típusa - DNS-t vagy RNS-t, hogy az alapja az osztályozás. A virion második kötelező összetevője, hogy a fehérjék különböző vírusokban különböznek egymástól, ami immunológiai reakciók révén felismerhetővé teszi őket.

A komplex vírusok a fehérjék és a nukleinsavak mellett tartalmaznak szénhidrátokat, lipideket. Minden víruscsoportnak saját fehérjék, zsírok, szénhidrátok és nukleinsavak vannak. Egyes vírusok enzimeket tartalmaznak.

Minden egyes eleme a virion specifikus funkciók: fehérje shell véd káros hatások, a nukleinsav felelős örökletes és a fertőző tulajdonságok és vezető szerepet játszik a variabilitás a vírus, és a részt vevő enzimek szaporodásukat. Általában a nukleinsav a virion közepén helyezkedik el, és egy fehérje bevonattal van körülvéve, mintha öltözött volna. A kapszid áll egy bizonyos módon hasonló halmozott fehérjemolekulák, amelyek kialakítják a szimmetrikus geometriai alakja, együtt a nukleinsav a vírusok. Abban az esetben, köbös szimmetria nukleokapszid nukleinsav szálával hengerelt egy labdát, és kapszomerek szorosan vannak körülötte. Tehát elrendezve polio vírusok, a száj és körömfájás, adenovírus, reovírusok, rhinovírusok, és mások. A spirál (rúd alakú) szimmetria-vírus nukleokapszid-nukleinsav szállal van csavarva egy spirális, minden körben annak lefedett kapszomerek szorosan egymás mellett. A kapszomerek szerkezete és a virionok megjelenése elektronmikroszkóppal megfigyelhető.

3. ábra - Diagram a humán immundeficiencia vírus (1 - kapszomerek 2 - gén 3 - lipoprotein burok (superkapsid); 4 - glikoprotvidy)

Komplex módon elrendezett vírusokban a magot, szorosan behajtott hélix formájában, egy vagy több külső héj borítja, amelyek különböző anyagokat tartalmaznak. Ilyen szerkezet például a himlő, az influenza és a parainfluenza vírusok. A vírus baktériumok - baktériumfágok (fágok) szerkezetét, amely egy fejből és egy farokból áll, részletesen tanulmányozták. A fág farkát egy fehérje bevonattal ruházzák fel, amelyből hosszú vékony szálak indulnak el, és a szopók szerepét játssza, amikor a fágrészecske a baktériumhoz kapcsolódik.

Dátum benyújtása: 2016-06-22; nézetek: 1281; RENDELJE A MUNKÁT

A vírusok vizsgálatának módszerei

VÍRUSOLT KUTATÁSOK - a vírusfertőzések diagnosztizálása céljából elvégzett vizsgálatok, releváns kórokozók tanulmányozása, terjedése a természetben, valamint a víruskészítmények előállítása. A virológiai laboratóriumokban (lásd) a mézet. A profil profilját emberi vírusokként vizsgálják, így egyes esetekben állati vírusokat (pl. kutyák veszettség diagnosztikája, víruskészítmények előállításához felhasznált állatok vizsgálata). Mindkét módszer vizsgálata hasonló.

V. és V. fázis egyik fő szakasza. a vírusok elszigeteltsége. Az emberek vírusainak elszigetelésével vér, különböző titkok és ürülékek, szervek darabjai. Leggyakrabban a vért arbovírusos megbetegedésekben vizsgálják. Használt teljes defibrinált vagy hemolizált vér, néhány eleme vagy vérrögje (a betegség késői szakaszában). A veszettség, a járvány, a parotitis, herpes simplex vírusok megtalálhatók a nyálban. Nasopharyngealis tamponokat izolálására használt kórokozók influenza, kanyaró, pszittakózis, tőpusi légúti óriássejtes vírus, az adenovírus. A kötőhártyában fellépő kipirulásoknál adenovírusokat is találtak. A mosást az orr és a garat (külön) öblítésével veszik, és a kötőhártyát izotóniás nátrium-klorid-oldattal mossuk. Az orrjáratokat és a garat hátsó falát törzsoldattal átitatott tamponokkal törölheti. A nem steril anyagot antibiotikumokkal (1000 egység penicillin és sztreptomicin / ml) kezeljük 30 percig. A székletből különféle enterovírusok, adeno- és reovírusok vannak elszigetelve. A mintákat foszfátpufferrel 1:10 arányban hígítjuk, kétszer 20 percig centrifugáljuk. 8000 RPM / perc sebességgel. Az antibiotikumokat a fentiek szerint adagoljuk. Kevésbé V. és. hogy a tartalma gennyes (himlő, bárányhimlő, herpesz) és pontszerű testek (a Lymphogranuloma venereum). A szekcionált anyagot a test halála után a lehető leghamarabb meg kell tenni. A vizsgálatot a t ° -20 ° -on és az alatti hőmérsékleten tárolják. V. és. szövetet őrölt (eldörzsöljük), és sűrű szuszpenziót készítünk 10-20% izotóniás nátrium-klorid-oldat vagy egy tápközeg a sejt-kultúrák. 20 percig centrifugáljuk. 1500 fordulat / perc; A felülúszót további vizsgálatokhoz használják.

A vírusok izolálására laboratóriumi állatok, madárembriók, sejt- és szövettenyészetek fertőzöttek. Állatok alkalmas abban az esetben, hogy a vírus okok egyértelmű klinikai tünetei a betegség vagy kóros elváltozás (pl., Bénulás, a tüdőgyulladás és a m. P.). A vírus tropizmusától függ az anyag bevezetésének egyik vagy másik módja. Széles körben használt fertőzés a bőr alá, intraperitoneálisan és intravénásan. Neurotróp vírusok által észlelt fertőzése az állatok a agyi félteke (arbovírusok, veszettség vírus, stb), a talamuszban (polio vírus a kísérletek majmok), a gerincvelő. A himlő és a herpesz vírusai kimutathatók a nyirokcsomóknak egy réselt szaruhártyán történő alkalmazásával. Egyes vírusok könnyen azonosíthatók, ha oltottuk az elülső kamrába (pl., Hepatitis B vírus kutyák kísérletileg kölykök). A tanulmány légúti fertőzések szerek szokásosan alkalmazott intranazálisan fertőzött állatok (cseppentés az orrba anyagot altatott állatoknak, vagy a beadást, az aeroszol formájában egy speciális kamrában). Az emésztőrendszerben az anyagot táplálékkal vagy a szájon keresztül tompa tűvel injektálják. Néhány onkogén vírus tanulmányozása során az arany hörcsögök fertőzését az orc-tasak nyálkahártyájába alkalmazzák.

Számos vírus esetében az újszülött állatok és szopósok érzékenyebbek a szexuálisan érett egyénekre. A szívó egereket széles körben alkalmazzák Arbovírusok és Coxsackie vírusok izolálására (fertőzés után az agyba). Egyes adenovírusok képesek újszülött arany hörcsögök szubkután fertőzésével daganatokat indukálni. Számos madárvírust tanulmányoznak az élet első napjaiban élő csirkéken.

A csirkeembriók használata számos előnnyel jár. A nem differenciálódott szövetek sokféle érzékenységgel rendelkeznek. A jelenléte a fertőzés bírálják el a halál a embrió, a megjelenése változik (hámlás) a chorio-allantois membrán (ábra. 1), a folyadék felhalmozódása az embrionális hemagglutinin és komplement-kötő virális antigén. Embriókat oltottunk a chorioallantois membrán (11 éves - 12 nap himlővírus-csoport) a allantois és amnion üregek (10-11 napos miksovirusami), szikzacskó (5-6 éves nap patogének psittakozaornitoza et al.). Az anyagnak az agyba és az intravénásan (a membránok edényeibe) történő embriójának inokulálása ritkán történik. Bármely fertőzés módszerével az embriók traumatizálhatók, így az első 24-48 órában megöltek. kizárt a könyvelésből.

A kemikus vírusok hatásának tanulmányozása. Az anyagok nagyon kényelmes embriómentes tojások, amelyekben az embriót eltávolítják, de a kórionóztikus membránt megőrzik. Belül a vírust és az anyagot 20 ml izotóniás nátrium-klorid-oldatba helyezzük. A héj nyílása egy csővel ellátott kupakkal van lezárva, amelyen keresztül mintákat vehet elemzésre.

A madarak embriókra és állatokra vonatkozó kísérletek értékelése során szem előtt kell tartani a látens fertőzések kiváltását vagy a látens vírus izolálását.

Széles körben a vírusok izolálására és felhalmozódására használják a sejt- és szövetkultúrákat (lásd). Ezeket a módszereket alkalmazhatjuk a legtöbb ismert vírus termesztésére (lásd: Vírusok termesztése). Néhányan közülük intenzíven felhalmozódnak már a termények elsődleges fertőzései alatt, míg mások több bejárást igényelnek. A legtöbb vírus szaporodását a sejttenyészetekben a citopátiás hatás kifejeződése kísérte. Természetéből adódóan egy bizonyos mértékig lehet megítélni tartozó vírusok egy adott faj: picornaviruses okoznak kerekítés és a sejt zsugorodás, adenovírus - megalakult klaszterek A kerek sejtek formájában szőlőfürt, miksovirusy és herpeszvírusok - megalakult a többmagos szinciciák. Számos vírus nem termeszthető a szervezeten kívül.

Sokszorosítása néhány vírus (himlő csoport mikso- és arbovírusok) lehet kimutatni gemadsorbtsii reakció mivel az érintett sejtek képessé adszorbeálására vörösvértestek. Megfelelő eritrociták (humán, majom, tengerimalac, csirke) koncentrációban 0,4-0,5% helyezünk egy egyrétegű t ° 4 ° vagy szobahőmérsékleten 20 30 percig. Eritrociták adszorbeált diffúz egész kultúra (pl., Parainfluenza vírus), vagy forma-szigetek (influenzavírusok, mumpsz).

A szaporodás a vírus néha megítélni vizsgálja a tenyésztő folyadékban állati (encephalitis) vagy az RNC. A citopatikus aktivitással nem rendelkező vírus jelenlétét néha befolyásolja a citopatogén vírus interferenciája. Így, tenyészetében csirkeembrió sejtek vírusokkal fertőzött madarakból a leukémia, gátolja a proliferációt, a Rous szarkóma vírus. Ahhoz, hogy a vírusokat netsitopatogennyh törzsek a hasmenés szarvasmarha és sertéskolera javasolt eljárás END (felmagasztalásával Newcastle-betegség-vírus) - felülfertőzés kultúrák Newcastle-betegség-vírus. Mindkét vírus együttes hatásával sejtpusztulás következik be.

Amikor a citopátiás változások vagy a vírusszaporítás egyéb jelei jelennek meg, a tenyésztőfolyadékot használják a vírus vagy a passzálás azonosítására. Számos vírus kötve marad a sejtekhez még kultúra degeneráció (adenovírusok, himlővírusok csoport) és ezáltal egy fagyasztva és felengedni folyékony tenyészetekben összegyűjtés előtt. Egyes herpetikus vírusokat, például a csirkék Marek-betegségének vírusát az intakt sejtekkel együtt át kell ültetni.

Humán légúti vértestek és mások esetében a szövettenyésztési módszert alkalmazzuk, vagyis a tenyésztett in vitro szövetfragmensek fertőzését. A leggyakrabban használt szövet a nyúl légcsője. A szaporodó vírus befolyásolja a nyálkahártya endotélsejtjeit, amelyet a csilló mozgásának megszüntetése határoz meg.

Figyelembe kell venni az idegen vírusok lehetőségeit a szövetek és sejtek tenyészetében. A sejteket sejtekkel lehet bevinni, ha az utóbbiak egy fertőzött szervezetből származnak, a tripszinből vagy a sejtek szaporítására használt szérumból.

Amellett, hogy vetés vagy szekcionált biopsziás anyag már nőtt tenyészet közvetlenül a sejtek tenyésztését vizsgálandó szerv után tripszinezéssel, gyakran hatékonyabbak ellen vírusizolálás (pl., A kimutatása adenovírus mandulák). Használhatók továbbá az összekevert tenyészetekhez az eljárás, amikor a teszt test sejtek növekednek együtt olyan vírus érzékeny az adott sejtek (pl., A sejtek telepítése az érintett betegek agyában a szubakut szklerotizáló panencephalitist majom vesesejtek vagy HeLa-sejtek izolálása kanyaróvírus). Az alkalmazás módja A kevert tenyészetek gyakran az egyetlen módja annak, hogy a vírust izoláljuk belőlük indukált tumorok állatokban, amelyek nem termelnek aktív vírus, azonban tartalmazzák a virális genom.

Az egyrétegű sejttenyészetek lehetővé teszik a vírusos plakkok telepeinek kinyerését (2. ábra). A plakkok rendszerint citopátiás aktivitással rendelkező vírusokat képeznek. Ugyanakkor, ez a módszer képes kimutatni néhány netsitopatogennye vírusok (pl., Számos törzsek hasmenést szarvasmarha). Plakkok előállítása céljából a vírust a sejt egyrétegű rétegen alkalmazzuk csészékben vagy lapos palackokban. A fertőzés sokfélesége, vagyis a sejtenkénti vírusrészecskék száma kicsi legyen, hogy a képződött plakkok ne merüljenek össze. 30-60 perc elteltével. réteges adszorpciós közegen 1,35 - 1,5% agar, és semleges vörös végső hígítás 1: 000 Kultúra 40 Petri-lemezeket atmoszférában egy 5-10% szén-dioxid, és a hermetikusan lezárt fiolákban - a hagyományos sütőben. Néhány nap múlva, az életben festett sejtek között, a degenerált sejtek festetlen fókusza megjelenik.

Az agart neutrális vörös színnel helyettesítheti a sejteken, és néhány nap múlva alkalmazzon egy második agar-réteget a festékkel; a plakkok néhány óra múlva válnak láthatóvá. Az agar néha poliszacharidok szulfátjait tartalmazza, amelyek a vírus növekedésének gátlói; Semlegesítésükhöz protamin-szulfátot (60 mg / 100 ml) adunk a közeghez. Számos vírus plakkjának előállítása céljából metil-cellulózt és egyéb anyagokat alkalmazhatunk bevonatokként. Egyes vírusok (himlő, kanyaró) plakkokat képeznek és agar bevonat nélkül. A plakk módszer lehetővé teszi a vírus törzsek klonális analízisét. A genetikailag homogén klónok izolálása céljából egy plakkot extrahálnak, amelyet a következő fertőzésre alkalmaznak. A klónozás általában három szakaszra vonatkozik.

A plakkok módszere alkalmas arra, hogy a fertőzött tenyészetben meghatározzuk a vírust termelő sejtek számát (azaz a fertőző központok számát). Ehhez a sejteket szuszpendáljuk, vírusérzékeny sejtek egyrétegű tenyészetére helyezzük és agarral töltjük. A fertőzött sejtek körül plakkok keletkeznek.

A vírusfertőzések diagnosztizálására és a vírusok antigénszerkezetének tanulmányozására a gélben lévő kicsapási reakciót alkalmazzák. Leggyakrabban agar használatos erre a célra. Az agar gélbe helyezett antigének és specifikus antitestek bizonyos távolságban diffúzok és fehér csapadék formájában csapadék képződnek. 0,8-1% agar izotóniás nátrium-klorid-oldatban vagy foszfátpufferben kapillárisokba helyezzük vagy rétegezzük. Az antigéneket előnyösen tisztítjuk és bepároljuk. A reakciók összetevői az agarra kerülnek a kapilláris ellentétes végeire vagy az üvegen az agarrétegben kialakított lyukakra, 5-6 mm távolságban. Az inkubálás 4-20 órát tart.

Jelentős számú V. és. a fény és az elektronmikroszkópos vizsgálatokat végezzük. A legnagyobb vírusokat (pl. Himlő) a megfelelő kezelés (ezüstelés, Viktória színezése stb.) Hagyományos fénymikroszkópos módszerrel kimutatható. Ezt a módszert használják a himlő diagnosztizálására a pustulákból származó anyagok vizsgálatával. Bizonyos fertőzésekre jellemző, hogy a sejtekben teloc-zárványok képződnek. Tehát a sejtmagokban a herpesz- és adenovírusfertőzéshez tartoznak a citoplazmában - a himlő (corpuscle Guarnieri) és a veszettség (Babesh-Negri test). A zárványok kimutatása fontos a veszettség, a himlő, a citomegalia, a szubakut szklerotizáló panencephalitis és más betegségek diagnózisában.

Mikroszkópia sötét területen (lásd Darkfield mikroszkópia) és fázis-kontraszt mikroszkóppal (lásd) a Chap. arr. hogy tanulmányozzák a vírusfertőzött sejtekben bekövetkező változások dinamikáját. Széles körben használt lumineszcens mikroszkópia (lásd).

Kenetek, nyomatok és egyrétegű sejtkultúrák feltárása üvegeken. A készítmények (natív vagy fix) gyakran akridin narancs színűek. A módszer lehetővé teszi a nagy vírusok és a víruskomponensek klasztereinek kimutatását. A világító zöld fényt tartalmazó DNS-sugárzás és az RNS-t tartalmazó formációk tégla vörösek. Még gyakrabban, amikor V. és. fluoreszcens antitestekkel fertőzött sejtek kezelését, amely lehetővé teszi a vírusantigén klasztereinek kimutatását. Közvetlen módszerrel fluoreszcens festékkel, például fluoreszcein-izotiocianáttal jelzett immun-gamma-globulint alkalmazunk. A közvetett módszerrel a készítményt egy állat szokásos immunszérumával kezeljük, majd az állat gamma-globulinjával jelölt antitestekkel. A készítményeket ultraibolya fényben vizsgálják, a vírusantigént könnyű zöld lumineszcenciával (lásd: Immunofluorescence). A nasopharynx tamponokból származó módszer lehetővé teszi a légúti vírusfertőzések - influenza, parainfluenza, rhino- és adenovírus, légúti szink-ciális - korai felismerését.

Az elektronmikroszkópia (lásd) lehetővé teszi a vírusrészecskék méretének és szerkezetének tanulmányozását, valamint a sejtekben okozott finom változásokat. Megvizsgáltuk a vírusos szuszpenziót vagy az ultra-vékony részeket a fertőzött sejtekről. Néhány vírus (pl. Számos humán és állati kukorica-vírus) kimutatható a szövetekben csak ezzel a módszerrel.

B. és., Kinek a célja - a vírus vagy vírus ellenanyagok mennyiségének (titerének) meghatározása nagyon különböző.

Az elektronmikroszkóp alatt a vírusrészecskék számát kiszámíthatjuk egy szuszpenzióban, ha megfelelően tisztítjuk. A vírust polisztirol latexekkel keverjük össze, az ismert részecskék számát. Az elegyet rácsra permetezzük, az egyes cseppekben lévő részecskék számát számoljuk. A latexszemcsék és a vírusok számának aránya az adott térfogatban lévő virionok számát mutatja. Ez a módszer nem ad elképzelést a vírus fertőző aktivitására, mivel a vírusszuszpenzió általában jelentős számú nem fertőző részecskét tartalmaz.

A legpontosabb módja annak, hogy meghatározzuk az anyagban lévő fertőző egységek számát, lehetővé teszi a plakkok módszerét. Az egyrétegű sejttenyészeteket a vírus egy kis dózisa fertőzte meg. A titert a plakk-képző egységek (PFU) száma 1 ml-ben fejezi ki. Hasonlóképpen, meg lehet határozni a vírus-titer bizonyos onkogén transzformáció a lakások, valamint azok a szerek, képeznek pockmarks a chorioallantois membrán csirke embriók (pl., Variola vírus).

A kevésbé pontos a vírus titer meghatározása a terminális hígítások módszerével. Állandóan növekvő hígításokat (általában tízszeresére) adunk be egy érzékeny állatra, csirke embriókra vagy sejttenyészetekre. Mindegyik injekció pozitív vagy negatív eredményét figyelembe véve meghatározhatja a vírus legalacsonyabb dózisát, amely bizonyos hatásokat (az állatok betegségét vagy halálát, a citopátiás változásokat a tenyészetben stb.) Okozhatja. Gyakorlatilag ez az adag nehezen meghatározható, ezért számolja ki az 50% -os hatást (ED50). A vírus tulajdonságaitól és az elhullott állatok számának titrálási módjától (LD50), az esetek száma (ID50), a vírusos hemagglutininek vagy komplementer-kötő antigének kifejlesztéséért felelős embriók száma azon sejtkultúrák számának megfelelően, amelyekben citopátiás változásokat vagy hemadszorpciós aktivitást észleltek. A titert az ED50-számmal fejeztük ki egy bizonyos mennyiségű anyagban.

Az ED50 számításának jelenlegi módszereit leginkább a kumuláció elvén alapuló Reed-Munch módszer alkalmazza. Ez azon a feltételezésen alapul, hogy minden egyes vizsgálati objektum (egér, embrió), amely pozitívan reagál a hígítás bevezetésére, pozitív reakcióra reagálna egy koncentráltabb vírus bevezetésére. És éppen ellenkezőleg, ha ez a hígítás negatív reakciót okozott, akkor egy nagyobb hígítás bevezetésével negatív reakció is lesz. A hígítások között ez a módszer azonos legyen, minden egyes tenyésztés legalább négy állat (tenyészet) fertőzését okozza. A dózisok további interpolációja, amely az 50% -ot megközelítő hatáshoz vezetett. A számítás a következő képlet segítségével történik:

ahol B - a legalacsonyabb dózis, amely okozott hatás több, mint 50%, b - A dózis-hatást százalékban, és - a legnagyobb dózis hatása okozta hatására kevesebb, mint 50%, a százalékos, d - közötti intervallum logaritmusa két szomszédos dózisok.

A kimondott citopátiás aktivitással rendelkező vírusok (pl. A polio vírus) titrálhatók színteszt módszerrel. Ez arra alapul, hogy a sejtek növekedése során a táptalaj pH-ja csökken, és a fertőzött tenyészetekben, ahol a sejtek degenerálódnak, nincs változás a táptalaj pH-jában. Ezeknek a változásoknak a detektálására fenolvörös jelzőt adnak a tápközeghez, amelynek pH-értéke 7-nél nagyobb, pH 7-es narancssárga színű és 7-nél alacsonyabb pH-nál sárga színű. A tápközeg, amelynek pH-7,3-7,4, így fenolvörös végső koncentrációja 1: 40 000. A minimális dózisát, sejtek, a közeg változó színű vörösről sárgára (jellemzően körülbelül 25 000 per 0,25 ml). Ezután elkészítjük a vírus 10-szeres hígításait, amelyek mindegyikét 4-6 tesztcsőbe öntjük, amelyhez sejtszuszpenziót adunk. A csöveket gumidugóval lezárják, vagy 0,6-0,8 ml vazelinolajat öntenek. Az eredményeket öregedés után 5-7 napig figyelembe veszik t ° 37 ° -ban. A vírus titertől vegyük fel a hígítást, megakadályozva a pH-értéket a savas oldalon a csövek 50% -ában.

Az immunszérumok azon képességét, hogy semlegesítsék a vírusok fertőző aktivitását, a semlegesítési reakció határozza meg. A szérumok titrálási módszereit a megfelelő vírusok titrálási módszerei határozzák meg. Ezek mindegyike a vírus szérum keverékének elkészítésén alapul, amelyeket ezután egy nem semlegesített vírus jelenlétére tesztelnek. Reakció két változatban. Az egyik ilyen immun és normál szérum hígításban (pl., 1: 10) összekeverünk növekvő 10-szeres hígítású vírus azonos térfogatú, és meghatározza a vírus titer jelenlétében mindkét szérum. Az ED hányadosa50 vírus a normál szérum jelenlétében ED50-gyel az immunitás jelenlétében, az immunszérum ezen hígításának semlegesítési indexe. Ezt az eredményt nem lehet interpolálni más szérumhígításokhoz (pl. A hígítatlan szérum aktivitása nagyobb lesz a számítottnál). Alternatív módon a vírus állandó dózisa (általában körülbelül 100 ED50) kombinálják a tesztszérum kétszeres hígításainak sorával. A szérumtiter hígítás lesz, a to-ry vírus 50% -os hatást vált ki.

Attól függően, hogy a vírus semlegesítési titrálási módszer a reakciót laboratóriumi állatokon csirke embriókból (által hemagglutinineket veszteség vagy felhalmozódás), sejttenyészetekben (a megjelenése citopátiás változások színminta és r. N.). Ha a vírus a csirke embriók chorioallantois membránján pontokat alkot, meghatározza a legnagyobb szérum hígítást, ami 50 vagy több százalékkal csökkenti a poxok számát. Hasonlóképpen, a szérumokat titrálják a vírusos plakkok számának csökkenése alapján az egyrétegű sejttenyészetekben.

Vírus titrálás RGA és HAI antitestek alapul a képessége, számos vírus (miksovirusy néhány képviselője a poxvírusok, adenovírusok, picornavírusok és Togaviridae) vörösvértestek összeragadnak. A vírust kétszeres hígításban titrálják azonos térfogatú 0,5-1% eritrocita szuszpenzióval. A titer (1 AE - agglutináló egység) esetén vegye be a legnagyobb hígítást, amely hemagglutinációt okoz (lásd). Hemagglutináló vírus titer egy intézkedés a fertőző tevékenység hemagglutinációs) okozhat a nem fertőző „hiányos” részecskék, inaktivált vírust, és elválasztható az egyes vírus hemagglutinációs antigén. Szérumok RTGA-ban kettős hígításban titrálva 2-4 AE vírussal; titer tekinthető a legmagasabb hígításnak, teljesen gátolja a hemagglutinációt).

Egyes vírusok az eritrocitákon adszorbeálódnak, de nem okoznak agglutinációt. A felismeréshez használhatja a közvetett hemagglutinációs reakciót. Ez a vírussal szembeni "vörösvérsejt-terhelt" vírus-specifikus szérum agglutinációján alapul. Ezt a módszert elsősorban a szérum titráláshoz alkalmazzák.

A komplementkötési reakció (lásd lásd) alkalmas mindkét vírus (pontosabban komplementkötő vírusantigének) és antitestek titrálására. Elvben az RSK vírusokkal nem különbözik a bakteriális és más antigénektől. A különbségek csak az antigének előállításának módjában léteznek. A virális antigének lehetnek a vér, nazofaringeális mosófolyadékot, vizeletben, székletben fertőzött betegek zagy szervek, részei fertőzött csirke embriókat és növesztjük sejttenyészetekben a vírus. A legalkalmasabbak a tenyésztési antigének. A szuszpenziók a fertőzött szervek a felhasználás előtt ismételten lefagyasztott és felolvasztott, kombinálva egy azonos térfogatú éterben vagy kloroformban, vortexeljük 1-2 órán át, majd állni hagyjuk 18-20 órán át. 4 ° C-on, ismét lefagyasztjuk, felolvasztjuk és tisztítjuk centrifugálással. A szérumok előállításához az állatokat nem szabad olyan vírussal immunizálni, amely ugyanazon szubsztráton tenyésztve van, mint a reakcióhoz használt antigén. Attól függően, hogy titrálás összefüggő célokra kétszeres hígítását antigén specifikus szérum dózis vagy, alternatív módon, kétszeres hígítású szérum be egy adag antigént. Az antigén, a szérum és a komplement érintkeztetését 1 órán át 37 ° C-on vagy 18 órán át végezzük. 4-6 ° C-on. A hemo-rendszer hozzáadását követően az anyagot 30 percig inkubáljuk. 37 ° C-on. Az eredményeket az általános szabályok szerint értékelik.

Vannak olyan eljárások, amelyek titrálják a vírusokat és antitesteket a vírusnak a fertőzött tenyésztő sejtekben fluoreszcens antitestekkel való jelzésén alapulva, valamint számos egyéb, ritkán használt vegyületet.

Az egyes vírusokban rejlő toxikus hatást kimutatták azáltal, hogy nagy dózisokat adtak az állatoknak szokatlan módon, amikor a vírus nem teljes reprodukciós cikluson megy keresztül. Például az influenzavírust egereknek adják az agyban vagy intravénásán. A toxikus hatásáról az állatok halála első napján számol.

A vírus (vagy oltóanyag) antigénaktivitását ember vagy állatok immunizálásával hozza létre, majd meghatározza az antitest titer szérumukban. A vakcina immunogén aktivitását, vagyis a fertőzéssel szembeni rezisztencia képességét a vírussal fogékony állatok immunizálása határozza meg. Ezután az immunizált állatok és a nem immunizált kontrollok fertőzöttek a vírus számos hígításával, meghatározva ED50 értékét mindkét csoport esetében. A kapott mutatók különbsége a vizsgált hatóanyag immunogenitását jellemzi. Ha a vírus nem patogén az állatok esetében, akkor a megfelelő vakcina immunogenitása csak epidemiolban határozható meg. tapasztalat.

A vírusok számos tulajdonságának (méret, szerkezet, kémiai összetétel stb.) Tanulmányozása érdekében nagy tisztaságú tisztított anyagot kell alkalmazni. A leggyakrabban használt vírust sejtkultúrákban vagy a fertőzött csirke embriók allantois folyadékának formájában termelik. Tisztítás általában kezdődik differenciális centrifugálás, először 15-20 ezer g (g- nehézségi gyorsulás) leválasztó anyag a sejtes törmeléket, és 50-100 ezer g - kicsapjuk maga a vírus... Hogy mentes a nagy részecskék is alkalmazni átszűrődő azbeszt tömítés (írja Seitz), üveg és cellulóz-membránon (Millipore típusú). A fragmentumok, amelyek kisebbek, mint a vírusok lehet szűréssel eltávolítjuk az anyag Sephadex gélek, a késedelem függően pórusméret egy bizonyos méretű részecskék. Az izoláláshoz és vírus koncentrációját nagy térfogatú használt kisózással ammónium- és nátrium-szulfátok, alkoholos kicsapás, alumínium-hidroxid vagy polietilén-glikol. A ballasztfehérjékből történő felszabadításhoz proteolitikus enzimekkel történő emésztést is alkalmaznak. A mikovírusok tisztíthatók és koncentrálódhatnak az alacsony vérnyomású vörösvértestekben történő adszorpcióval, magasabb hőmérsékleten eluálva.

A vírus további tisztítását és koncentrációját ez vagy a frakcionálási eljárással állítják elő. Ezeket a módszereket a mutáns vírusok és az egyedi víruskomponensek elválasztására is használják. Keverésekor a vírus egy kétfázisú rendszer vizes oldatai két polimer, bemegy a fázisok egyikének méretüktől függően, ionos a tápoldat összetétele, pH, stb tisztítására nagy vírusok jellemzően dextrán rendszer -. Metil-cellulóz, kis - dextrán-szulfát a polietilén-glikol. A fázisszétválasztást követő polimerek gyakran eltávolításra kerülnek a vírus további tisztítása során. A dextrán-szulfátot kálium-klorid, metil-cellulóz ammónium-szulfáttal, polietilénglikollal és kloroformmal történő hozzáadásával is eltávolíthatjuk.

Vírus A nyersterméket oszlopkromatográfiával tisztítjuk képességük alapján, hogy adszorbeálható számos anyagot, és eluáltuk (lásd. Kromatográfia) a változó pH vagy a sókoncentráció. Használt adszorpciós kalcium-foszfát-gél, ioncserélők alapuló cellulóz (általában anioncserélők, például DEAE) ioncserélő gyantát. Az eluálást a vírus végezzük kalcium-foszfát-foszfát-puffer növekvő koncentrációjú és ioncserélőkkel alapuló cellulóz - nátrium-klorid-oldatok.

A nagyon tisztított szuszpenziókat centrifugálással nyerjük folyékony oszlopban, folyamatos gradienssel eloszlatva. A vírusrészecskéket olyan szinten gyűjtjük össze, ahol a táptalaj sűrűsége megegyezik azok mozgó sűrűségével. A szacharóz gradiensben végzett zonális centrifugálás lehetővé teszi a különböző tömegű részecskék elválasztását. Az anyagot a megfelelő szacharózoldatok rétegezésével létrehozott gradiensre alkalmazzuk. A centrifugálás végén a frakciókat összegyűjtik, a cső alját átszúrják. Az egyensúlyi vagy izopiknikus centrifugálás során a vírusrészecskéket cézium-klorid, cézium-szulfát vagy rubídium-klorid oldatában szuszpendálják. Hosszabb centrifugálás után az oldat stabil, folyamatos sűrűségű gradiensét hozza létre. A vírusrészecskék helyén meghatározhatják sűrűségüket. Meg kell jegyezni, hogy a vírusrészecskék sűrűségének és tömegének adott értékek bizonyos mértékig függenek a centrifugálás során alkalmazott közegtől.

Amikor V. és. A különböző radioaktív izotópokkal jelölt vírusokat széles körben használják. A leggyakrabban használt szén 14 C, trícium 3 H, foszfor 32 P, kén 35 S, 131 jód. A legegyszerűbb a vírus címkézése, ha tenyésztettük a sejttenyészetekben. A radioaktivitást folyadék szcintillációs számlálókkal vagy autoradiográfiával határoztuk meg (lásd).

Chem. a vírusok összetételét a hagyományos kémia vizsgálja. módszereket. A nukleinsavat általában fenolos extrakcióval nyerik, és kevésbé használnak anionos detergenseket, dodecil vagy nátrium-lauril-szulfátot.

A vírusok azonosítására (lásd) először meg kell állapítani a generikus tartozékot. Ehhez meg kell határozni a vírusrészecskék méretét és szerkezetét, a nukleinsav típusát, a lipoid bevonat jelenlétét. Típus nukleinsav a-gyakran határozza közvetett módszerekkel, például a bróm-dezoxiuridin képességét, hogy gátolják a DNS-t tartalmazó vírusok. A vírus jelenlétét a lipoid shell szerelt annak érzékenységét a fellépés éter és a kloroform (inaktivált vírusok, amelyek boríték). További azonosítás végezzük egy sor antiszérumpreparátumot az ismert vírusok különféle reakciók -. Semlegesíteni, DGC, HI, stb Kevesebb immunizált állatok termelnek ismert vírus további ismeretlen szennyeződés, vagy fordítva.

Irodalom: A vírusos és rickettsi betegségek laboratóriumi diagnosztikája, szerk. E. Lennet és N. Schmidt, per. angolul, M., 1974, bibliograf.; Luria G. Ye., És Darynl JE, Általános virológia, transz. angolul, M., 1970, bibliograf.; Virológiai és molekuláris biológiai módszerek, transz. angolul, M., 1972; VA Shchennikov-Sh., Semenov BF иЗезе-р о в Е. Г. / Virológiai kutatások módszereinek szabványosítása, M., 1974, bibliograf. Kézikönyv a vírusos és rákos megbetegedések laboratóriumi diagnózisához, ed. PF Zdrodovsky és MI Sokolov, M., 1965; Sokolov MI, Sinitskii AA és Remezov PI Virológiai és szerológiai vizsgálatok vírusfertőzésekben, L., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.

A vírusok vizsgálatának módszerei

A vírusok tanulmányozásának módszereinek megkülönböztető jellemzői. Az elektron- és immunelektronikai mikroszkópia lényege, jelentősége és alkalmazása, az immunfluoreszcencia módszer specifikussága. A molekuláris hibridizáció módszerének leírása. Az elektronmikroszkóp rendszere.

A jó munka elküldése a tudásbázisba könnyű. Használja az alábbi űrlapot

Diákok, végzős hallgatók, fiatal tudósok, akik a tudásbázisot tanulmányaik és munkájuk során használják, nagyon hálásak lesznek Önöknek.

Hosted on http://www.allbest.ru/

Az Orosz Föderáció Oktatási és Tudományügyi Minisztériuma

Szövetségi állami költségvetés oktatási intézmény felsőfokú szakképzés

Természettudományi Kar

Botanikai és Genetikai Tanszék

A vírusok vizsgálatának módszerei

Befejezett: Evteeva D.S.

VÍRUSOK VIZSGÁLATI MÓDSZEREI

A VÍRUSOK ELEKTRONIKUS MIKROSZKÓPÁJA

A MOLEKULÁRIS HYBRIDIZÁCIÓ MÓDSZERE

A HASZNÁLT LETRERÁCIÓ JEGYZÉKE

A vírusok az intracelluláris paraziták kötelezőként nem tudnak növekedni a mesterséges táptalajon. Csak a fertőzésre fogékony állatok szervezetében vagy a vírusra érzékeny élő sejtekben reprodukálhatók.

A vírusok tanulmányozásához a fogadó gazdaszervezetet használják olyan esetekben, amikor nincsenek kísérleti rendszerek a vírusfertőzések patogenezisének tanulmányozására, a vírusos vakcinák biztonságosságának vagy a vírus gyógyszerek. A nyilvánvaló előnyök mellett a módszereknek hátrányai és korlátai vannak az eredmények standardizálásának és reprodukálhatóságának nehézségeivel, valamint a kísérletek viszonylag magas költségei miatt.

Az 1940-es években a kutatási gyakorlatba bevezetett sejtkultúrák radikálisan megváltoztatták a virológia módszertani arzenálját.

Jelenleg a kulturális módszerek alapvetőek a kísérleti és gyakorlati virológia terén.

A virológiai vizsgálati módszerek jelentősen különböznek a komplexitásban, ami elsősorban a vírusok abszolút intracelluláris parazitizmusa és kis méretük miatt következik be.

VÍRUSOK VIZSGÁLATI MÓDSZEREI

A virológiai vizsgálati módszerek jelentősen különböznek a komplexitásban, ami elsősorban a vírusok abszolút intracelluláris parazitizmusa és kis méretük miatt következik be.

A vírusfertőzésben szenvedő betegekből származó anyagok vizsgálata során különböző módszereket alkalmaznak a fenti betegségek laboratóriumi diagnózisára:

· Elektron- és immunoelektromos mikroszkópiai módszerek;

· A molekuláris hibridizáció módszere;

· Immunfluoreszcencia módszer;

· Az lgM osztályú antitestek azonosítása.

ELEKTRONIKUS MIKROSZKÓPOS

Az elektronmikroszkópos módszer a fénymikroszkóp láthatóságának határán kívül eső szerkezetek tanulmányozására és egy mikronnál kisebb méretű (1 mikronról 1-5 A-ra) történő mérésére.
Action elektronmikroszkópos (Pril.1.ris.1) alapul használatát irányított elektron fluxus, amely arra szolgál, mint egy fénysugár egy fénymikroszkóp, és a szerepét lencsék mágnesek (mágneses lencse).

Tekintve, hogy a vizsgált tárgy különböző részei különböző módon reteszelik az elektronokat, az elektronmikroszkóp-képernyőn egy tizedik és több százezer alkalommal nagyított fekete-fehér képet kapnak a vizsgált tárgy fekete-fehér képeiről. A biológiában és az orvostudományban elsősorban az áttetsző típusú elektronmikroszkópokat alkalmazzák.

Az 1930-as években az elektronmikroszkópos felvétel során néhány vírus (dohánymozaik vírus és bakteriofágok) első képét kaptuk. Jelenleg az elektronmikroszkópia a legszélesebb alkalmazást találja a citológia, a mikrobiológia és a virológia területén, ami új tudományágakat hoz létre. A biológiai tárgyak elektronmikroszkópos vizsgálatával speciális előkészítési módszereket alkalmaznak. Ez azért szükséges, hogy azonosítsák a vizsgált tárgyak (vírus) egyedi összetevőit, valamint megőrizzék szerkezetüket nagy vákuumban az elektronnyaláb alatt.

Az elektronmikroszkópos vizsgálattal tanulmányozzák a tárgy külső formáját, felülete molekuláris szervezését, az ultra-vékony szakaszok módszerét alkalmazva, vizsgálják az objektum belső szerkezetét.

Elektronmikroszkópos kombinálva biokémiai, citokémiai kutatási módszerek, immunfluoreszcens, és a röntgendiffrakciós elemzés betekintést nyújt az összetételtől és funkciók a szerkezeti elemek a sejtek és vírusok.

A negatív kontrasztanyaggal festett vírusok elektronmikroszkópos vizsgálata lehetővé teszi a vírusok differenciálódását és koncentrációjuk meghatározását. Az elektronmikroszkópos vizsgálat a vírusfertőzések diagnózisában olyan esetekre korlátozódik, amelyekben a vírusrészecskék koncentrációja a klinikai anyagban elég magas (105 ml / ml vagy ennél több).

A módszer hátránya, hogy nem lehet megkülönböztetni az azonos taxonikus csoportba tartozó vírusokat. Ezt a hiányt megszüntetik az immunmikroszkóppal.

Az eljárás immunkomplexek képződésén alapul, amikor specifikus szérumot adnak a vírusrészecskékhez, miközben a vírusrészecskék egyidejű koncentrációja lehetővé teszi azok azonosítását. A módszer az antitestek kimutatására is használható. Expressz diagnosztika céljából a szövetek, a széklet, a hólyagok folyadékának elektronmikroszkópos vizsgálata, a nasopharynx titkai kerülnek végrehajtásra.

Az elektronmikroszkópiát széles körben használják a vírus morfogenezisének tanulmányozására, lehetőségét kiterjesztik jelzett antitestek alkalmazásával.

IMMUNEELECTRONIC MICROSCOPY

Az antigén és antitestek elektronmikroszkóppal történő interakciójának közvetlen vizualizációját javasolta először J. Almeida és A. Waterson virológiai vizsgálatokra 1969-ben.

Módszeresen az IEM-tesztet a következő sorrendben végezzük:

1. Az anyagot, amelyben a kívánt vírus gyanúja van, összekeverik és standard immunszérummal inkubálják;

2. A vírus-ellenanyag-komplexet centrifugálással kicsapjuk megfelelő reakciókörülmények között;

3. Az újraszuszpendált üledékhez egy kontrasztanyagot adunk, és az így kapott készítményt elektronmikroszkóp alatt vizsgáljuk.

Pozitív reakció esetén kiderül, hogy az antitestek hidakkal összekötött virális részecskékből álló jellemző aggregátumok vannak. Az IEM érzékenységi küszöbe alacsony: a vírus megbízható kimutatása akkor lehetséges, ha a kiindulási anyag koncentrációja 10 ^ 4-10 6 részecske / ml.

A módszer előnye nem csak a szerológiai reakció kimenetele, hanem a morfológiai szubsztrát azonosítása is, azaz a vírusrészecskék alakjának és méretének meghatározása. Az ismert szennyezőanyag-tartalmú vírus preparátumok jelenlétében az IEM alkalmazható antitestek kvantitatív meghatározására szérumokban, amelyekre speciális rendszert javasolnak a vírus és antitestek interakciójának intenzitásának rögzítésére.

Szerológiai módszerek in Virology alapuló klasszikus immunológiai reakciók: a komplement rögzítését, hemagglutináció gátlás, biológiai semlegesítés, immundiffúziós, közvetett hemagglutinációs, radiális hemolízis, immunfluoreszcencia, enzim-immunassay, radioimmunassay. Számos reakció mikromódszereit fejlesztették ki, technikáját folyamatosan javítják.

Ezeket a módszereket azonosítani vírusok alkalmazásával ismert halmaza szérumok szerodiagnosztizálására és meghatározza a növekedés antitest a második szérum képest az első (az első szérum után vett az első napokban a betegség, a második - 2-3 hét után.). A diagnosztikai érték nem kevesebb, mint az antitestek négyszeres növekedése a második szérumban. Ha az IgG antitestek kimutatása közelmúltbeli fertőzést jelez, akkor az IgG antitestek több éven át fennállnak, és néha az életre is. A fehérjék előzetes tisztítása nélkül komplex keverékekben lévő vírusok és antitestek egyedi antigénjének azonosítására immunoblotot alkalmazzunk.

Az eljárás a fehérje frakcionálását egy poliakrilamid gélben elektroforézissel ötvözi, amelyet fehérjék immunológiai vizsgálata követ egy enzim immunvizsgálattal. A fehérjék elválasztása csökkenti az antigén kémiai tisztaságának követelményeit, és lehetővé teszi az antigén-antitest egyes párjai azonosítását. Ez egy fontos probléma, mint például a szerodiagnosztizálására HIV, ahol a hamis pozitív reakciók immunmeghatározási miatt az antitestek jelenlétét a celluláris antigéneket, amelyek jelen vannak, mint az elégtelen tisztítása virális fehérjék.

Az antitestek azonosítása a betegek szérumaiban a belső és külső vírusantigének számára lehetővé teszi a betegség stádiuma és a populációk analízisét - a vírusfehérjék változékonyságát.

A HIV-fertőzéssel szembeni immunoblotot megerősítő tesztként alkalmazzák az egyes vírusantigének és antitestek kimutatására. A populációk elemzése során a módszert alkalmazzuk a vírusfehérjék változékonyságának meghatározására.

A módszer nagy értéke a rekombináns DNS-technológiával szintetizált antigének elemzésének lehetőségével, a méretük és az antigén determinánsok jelenlétének megállapítása révén.

vírus molekuláris hibridizációs mikroszkóppal

Az immunfluoreszcens módszert vagy az immunfluoreszcencia reakciót (RIF) fluoreszcens mikroszkóppal felszerelt mikrobiológiai laboratóriumokban alkalmazzák.

A vizsgálatban közvetlen és közvetett immunfluoreszcens reakciókat alkalmaznak.

Ha az immunfluoreszcencia közvetlen reakcióját diagnosztikai célokra használják, az etanollal rögzített klinikai anyagot kell alkalmazni a diára.

Ezután lumineszcens szérumot adunk hozzá. Végezzen egy kábítószert egy lumineszcens mikroszkóp alatt.

Az antigén-antitest immunológiai reakciója közvetlenül a csúszkán történik. Például, az influenza antigén, amely csatlakozott egy jelölt immunglobulin, mikroszkóp alatt a formája fényes izzó részecskék elosztott a sejtmagban, és a fertőzött sejtek citoplazmájában. A módszer egyszerű, de mindenfajta antigénhez lumineszcens szérumot igényel.

Az immunfluoreszcencia közvetett reakciójának lényege, hogy először a csúszkán az antigén egy specifikus (nem jelölt) szérumhoz kötődik. A lumineszcens szérumot hozzáadjuk az üvegen kialakított antigén-antitest komplexhez.

Az utolsó lépés egy mikroszkópia, amely azonosítja a jelzett komplexeket.

Ez a módszer kis mennyiségű lumineszcens szérumot fogyaszt, így széles körben alkalmazzák bakteriális, rickettsialis, pneumocystis fertőzések kimutatására.

Könnyű azonosítani az influenzavírusokat, a parainfluenza, az adenovírusok, a légzőszervi syncytial vírus, a citomegalovírus. A legionella és a klamidia fertőzésének diagnosztizálását immunfluoreszcencia reakcióval kell végezni a megfelelő antigén meghatározásához.

A MOLEKULÁRIS HYBRIDIZÁCIÓ MÓDSZERE

A vírus-specifikus nukleinsavak kimutatásán alapuló molekuláris hibridizáció módszere lehetővé teszi a gének egy példányának kimutatását és az érzékenység fokának hiányát.

A reakció a DNS vagy RNS (szondák) komplementer szálak hibridizációján és a kettős szálú szerkezetek képződésén alapul. A legolcsóbb szonda klónozott rekombináns DNS. A szondát radioaktív prekurzorokkal (általában radioaktív foszforral) jelöltük. A kolorimetriás reakciók várható felhasználása.

A molekuláris hibridizáció számos változata létezik: pont, blot hibridizáció, szendvics hibridizáció, in situ hibridizáció stb.

A HASZNÁLT LETRERÁCIÓ JEGYZÉKE

1) Vírusfertőzések laboratóriumi diagnózisa, NN Nosik, V.M. Stakhanov

2) Virológiai Intézet. D. és. Ivanovo RAMS, Moszkva ; laboratórium diagnózis az vírusos fertőzések, N. N. Nosik, V.M. Stachanova

3) Az emberi és állati vírusok anatómiájának és ontogenezisének atlase, AA Avakyan, AF Bykovskii, 1970

4) A Virus Planet, Carl Zimmer, 2012

5) http://www.serdechno.ru/enciklopediya/3171.html